Due gruppi di ricerca dell’Institute for Protein Design dell’Università di Washington, coordinati da David Baker e con la partecipazione di Donald Hilvert dell’ETH di Zurigo, hanno sviluppato mediante progettazione computazionale nuove proteasi artificiali capaci di riconoscere e tagliare specifiche sequenze proteiche, comprese regioni appartenenti a proteine umane associate a patologie. I risultati, pubblicati il 14 ottobre 2026 su Nature in due studi distinti, riguardano enzimi progettati da zero attraverso tecniche di intelligenza artificiale, modellazione strutturale e ottimizzazione sperimentale. Le proteasi ottenute sono in grado di catalizzare l’idrolisi dei legami ammidici dello scheletro polipeptidico, una reazione particolarmente complessa per la stabilità chimica dei legami coinvolti, che in una soluzione acquosa neutra possono persistere per centinaia di anni in assenza di catalisi efficace. La progettazione ha seguito due strategie molecolari differenti, basate rispettivamente su centri catalitici contenenti zinco e sull’attivazione nucleofila di residui di cisteina.
Il primo studio, dedicato alle metalloproteasi, ha utilizzato metodi derivati da RFdiffusion per generare strutture proteiche contenenti un sito attivo coordinato con uno ione zinco, collocato in prossimità di una regione capace di riconoscere il substrato peptidico. Lo zinco svolge un ruolo essenziale nell’attivazione di una molecola d’acqua coinvolta nell’idrolisi del legame bersaglio, mentre la geometria del sito catalitico determina il posizionamento del substrato e la selettività della reazione. Tra i 135 progetti sperimentati, il 36% ha mostrato attività catalitica verso il rispettivo peptide bersaglio. I ricercatori hanno successivamente perfezionato alcuni enzimi mediante mutagenesi e selezione di varianti, esaminando nel caso del progetto Zn45 un totale di 378 varianti con sostituzioni in singole posizioni e 148 combinazioni di mutazioni distribuite su sei posizioni. La variante ottimizzata Zn45_v2 è stata caratterizzata attraverso misure cinetiche di Michaelis-Menten e del numero totale di cicli catalitici, mentre analisi cristallografiche e simulazioni di campi di forza hanno permesso di confrontare le configurazioni dei siti attivi con quelle delle proteasi naturali.
Le metalloproteasi progettate hanno dimostrato la capacità di tagliare selettivamente regioni delle proteine TDP-43, amiloide-β e amiloide A sierica, raggiungendo incrementi della velocità di reazione fino a un miliardo di volte rispetto all’idrolisi spontanea. Tra i progetti sperimentali figurano TDPr3, sviluppato per agire su TDP-43, SAAc8, indirizzato alla sequenza SSRSFFSFLG della proteina amiloide A sierica, e AbetaF3, progettato per riconoscere una sequenza dell’amiloide-β. Per TDP-43 è stato scelto un sito di taglio nella regione C-terminale intrinsecamente disordinata, coinvolta nella separazione di fase liquido-liquido e nella formazione di oligomeri; la strategia consente di intervenire sulle proprietà di aggregazione della proteina preservando, nel modello sperimentale, le regioni strutturate responsabili delle sue funzioni nucleari. Gli stessi principi di selettività sono stati impiegati per sviluppare citochine e antagonisti recettoriali attivabili mediante specifiche proteasi artificiali, con l’obiettivo di controllare sperimentalmente lo stato funzionale delle cellule.
Il secondo studio ha introdotto una famiglia di proteasi a cisteina generate mediante RFD2-MI, un metodo di deep learning impiegato insieme a ProteinMPNN e AlphaFold 3 per progettare lo scheletro tridimensionale, definire le sequenze amminoacidiche e selezionare le configurazioni strutturali più promettenti. Su 69 proteine sperimentate, 13 hanno mostrato attività catalitica, corrispondenti a una percentuale di successo del 19%, con accelerazioni delle reazioni fino a 30 milioni di volte. Le strutture ottenute presentano ripiegamenti significativamente differenti da quelli delle proteasi naturali, mentre sei strutture cristallografiche hanno confermato una corrispondenza con i modelli computazionali entro 1,2 ångström di deviazione quadratica media per gli atomi Cα. L’ottimizzazione di una proteasi denominata Dokki ha prodotto 24 varianti migliorative su 89 esaminate, con incrementi di attività fino a 31 volte e una variante particolarmente efficace identificata come Dokki-15. Gli esperimenti condotti su cellule HeLa hanno inoltre documentato la capacità degli enzimi progettati di tagliare i rispettivi substrati in ambiente cellulare, attraverso sistemi reporter e controlli costituiti da mutanti cataliticamente inattivi. I risultati riguardano una fase di ricerca molecolare e preclinica, nella quale la selettività del taglio e l’attività catalitica costituiscono le principali proprietà dimostrate; le possibili applicazioni terapeutiche richiederanno ulteriori verifiche relative a stabilità, sicurezza, specificità e comportamento negli organismi viventi.
Questo articolo è stato redatto con il supporto di strumenti di intelligenza artificiale (AI)